鋁吸附疫苗產品穩定性研究與方法

鋁化合物作為人用疫苗佐劑已有75年以上的歷史，是人用和獸用疫苗中使用最廣泛的佐劑。數十億劑含鋁鹽的疫苗已安全地用于全球不同的人群。盡管它們被廣泛使用，但關于這些產品的作用機制和穩定性研究的監管指南或者已發表的文獻很少。盡管在治療性蛋白化學和物理穩定性方面的知識取得了很大進展，但很少有已發表的將生物分析穩定性方法應用于蛋白質吸附到鋁佐劑上的例子。本文介紹了鋁吸附疫苗，并討論了抗原穩定性的研究。

　　鋁吸附疫苗

　　早期的疫苗佐劑使用的是明礬沉淀物制備的，這可能是異質的。之后，預先形成的氫氧化鋁凝膠和后來的磷酸鋁取代了明礬沉淀，并產生了鋁吸附疫苗的標準化配方。隨著重組表達蛋白抗原的鑒定，鋁基佐劑繼續用于新疫苗制劑中，可以作為滅活或減毒病原體的更安全替代品。此外，含有將鋁與合成和天然配體連接起來的組合佐劑的疫苗已獲批準。通常需要添加佐劑來誘導免疫反應和對可能不具有強免疫原性的蛋白質抗原進行有效的免疫。然而，鋁佐劑的作用方式，我們還沒有完全理解。潛在的機制包括鋁在注射部位形成一個局部的高濃度范圍，抗原從中緩慢釋放;吸附疫苗的顆粒形式導致巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞攝取;并且直接刺激免疫系統。此外，有人提出蛋白質在鋁凝膠上的吸附會導致結構不穩定，從而增加蛋白質的免疫原性。

　　人用疫苗中常用的鋁鹽制劑有兩種：氫氧化鋁(Alhydrogel)和磷酸鋁(Adju-Phos)。鋁佐劑的凈表面電荷為零時的pH值稱為零電荷點(point of zero charge，PZC)，類似于蛋白質的等電點(pI)。當溶液pH值低于PZC時，佐劑表面帶正電，當溶液pH值大于PZC時，佐劑表面帶負電。氫氧化鋁的PZC約為11，磷酸鋁的PZC為4-5.5，但應考慮疫苗制劑中使用的緩沖液，因為表面的離子置換可能會降低PZC并影響對抗原的吸附。對于許多蛋白質，抗原吸附在蛋白質抗原的pI和鋁佐劑的PZC之間的pH內最好，因為在此pH范圍內，蛋白質抗原和佐劑具有相反的電荷。因此，溶菌酶的pI為11.35，已被用作磷酸鋁研究中的模型抗原。牛血清白蛋白(pI為4.7)和卵清蛋白(pI為4.5)更有效地與氫氧化鋁結合。通常，Alhydrogel比Adju-Phos 具有更高的吸附能力，并且Alhydrogel的吸附能力隨著其粒徑的增加和蛋白質分子量的增加而降低。已被用作磷酸鋁研究中的模型抗原。牛血清白蛋白(pI為4.7)和卵清蛋白(pI為4.5)更有效地與氫氧化鋁結合。蛋白質對鋁佐劑的吸附機制尚不完全清楚，可能是物理現象的組合，包括“靜電引力、氫鍵、非極性相互作用、配體交換和范德華力”。對模型蛋白的研究發現靜電相互作用是溶菌酶、人類生長激素、白喉類毒素、單克隆抗體和聚乙二醇化生長激素的主要吸附機制，但對于卵清蛋白，吸附涉及配體交換。氫氧化鋁吸附HBsAg的主要機制被確定為HBsAg中的磷脂與氫氧化鋁佐劑中的表面羥基之間的配體交換。當磷酸鹽緩沖液的濃度增加時，HBsAG與硫酸羥基磷酸鋁佐劑結合得更緊密。吸附強度與疫苗有效性的相關性與吸附機制有關。通過配體交換吸附的磷酸化蛋白質在高吸附強度與較差的抗原呈遞和免疫反應之間具有反比關系。對三價肺炎球菌蛋白疫苗的研究表明，佐劑的選擇會影響免疫原性，從而導致免疫原性的差異，并發現抗原表面微環境pH值較低和吸附強度降低可改善抗原穩定性。吸附強度與疫苗有效性的相關性與吸附機制有關。通過配體交換吸附的磷酸化蛋白質在高吸附強度與較差的抗原呈遞和免疫反應之間具有反比關系。

　　吸附后抗原穩定性

　　疫苗制劑開發的一個重大挑戰是了解吸附后的抗原穩定性。雖然鋁沉淀和鋁吸附疫苗已經使用了75年，但只有在過去15年中才報道了研究吸附對蛋白質結構和穩定性影響的研究，是因為開發了表征重組體的新技術被應用于疫苗研究。科學家描述了佐劑表面的蛋白質環境與溶液中的環境有何不同，這可能會導致結構變化。具體來說，對吸附在氫氧化鋁上的1-磷酸葡萄糖(G1P)的酸催化水解速率的研究得出結論，佐劑表面微環境的pH值比本體溶液的pH值高約兩個pH單位。佐劑表面極性和電荷密度的差異也可能導致結合蛋白結構的變化。

　　光譜方法已應用于研究由吸附引起的蛋白質結構擾動。包括熒光光譜、透射傅里葉變換紅外 (FTIR)光譜、使用衰減全反射(ATR)池的FTIR光譜，以及圓二色性(CD)。差示掃描量熱法(DSC)也已被應用。在模型疫苗的研究中，通過FTIR-ATR、熒光光譜技術和DSC通過吸附觀察到結構變化。使用透射FTIR的研究得出結論，在六種模型蛋白質的研究中，吸附沒有導致結構變化。總體而言，研究表明緩沖液濃度的變化，緩沖液pH值和抗原本身的特性可能會影響吸附的蛋白質抗原的結構。在乙型肝炎疫苗的研究中，抗原和氫氧化鋁佐劑之間的相互作用通過優化磷酸根離子濃度而改變，并可能確保維持抗原的天然濃度。雖然沒有提供結構信息，但得出了結論，含有40mM磷酸鹽的制劑通過以下方式提高了熱穩定性。通過優化磷酸根離子濃度來改變抗原和氫氧化鋁佐劑之間的相互作用，并確保維持抗原的天然濃度。此外，FTIR-ATR研究確定結構變化取決于吸附的蛋白質量，在具有最大吸附量的樣品中觀察到更多的蛋白質。我們推測，在較低的吸附濃度下，會形成一個單分子層，其中吸附蛋白質受佐劑表面性質的影響，并且更加具有可變性。在更高的吸附水平下，蛋白質的連接更弱，可能會保留天然結構，雖然鋁吸收疫苗特性研究的重點是蛋白質抗原結構。

　　疫苗穩定性研究的監管指南

　　關于鋁吸附疫苗的作用機制和穩定性測試方法幾乎沒有一般性指導文件。FDA文件《疫苗或相關產品的工業指南、化學、制造和控制信息的內容和格式以及企業描述信息》指出，藥物產品發布規范中應包括特性、純度和效力，但不提供具體的測試方法或指導。美國藥典(USP)第<1235>章人用疫苗——一般注意事項沒有提供超出效力、一般安全性、無菌性、純度、特性和成分材料測試的一般要求的釋放和穩定性測試的具體建議。目前，只有一部鋁吸附疫苗 USP專著(Anthrax Vaccine Adsorbed)，但在2018年8月被刪停用。該指導包括對不含鋁的無菌濾液進行的測試。對無菌濾液進行的測試包括蛋白質印跡鑒定、根據USP<1057>使用Bradford測定法檢測總蛋白和使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測蛋白質。成品測試包括在體內相對效價、原子吸收光譜法測定鋁濃度、安全性、無菌性、pH值、離子選擇性探針測定氯化鈉、滴定法測定芐索氯銨，以及使用紫外-可見光譜法測定甲醛的限度測試。

　　雖然沒有關于包含效力指示的測試方法的具體指導，但可以從國際協調委員會(ICH)Q5E可比性的生物技術/生物制品的可比性中得出一些相似之處。在他們的制造過程中，該指南指出，“制造商應考慮生物測定的局限性，例如高變異性，這可能會阻止檢測由于制造過程變化而發生的差異。”然而，也指出，“在生物測定還作為物理化學分析的補充(例如，作為高階結構的替代測定)的情況下，使用具有適當精密度和準確度的相關生物測定可能會提供合適的確認特定高階結構在制造過程更改后沒有發生變化的方法。”雖然此分析的目的是評估穩定性而不是制造變化，但該指南可以外推到穩定性測試方法。

　　測試方法

　　理想情況下，為吸附的疫苗產品提供穩定性數據的測試方法不需要大量的樣品制備或從佐劑中解吸抗原。有多種不同的適用于解吸的機制，但都有共同的缺點。解吸過程本身可能導致蛋白質抗原中的結構變化或額外的修飾或雜質。對于大多數測試方法中的分析，解吸的樣品需要進行緩沖液交換步驟，這將導致溶液濃度未知，在通過穩定性指示方法進行分析之前，必須使用單獨的分析來確定該濃度。最后，解吸回收率可能會有所不同，樣品的回收率可能會降低。

　　根據其定義，未結合抗原的測量是在未解吸的成品(finished drug product，FDP)上進行的。該測試方法的目的是測量未從鋁佐劑吸附或已解吸的游離蛋白質的量。通過離心制備樣品，并除去上清液進行分析。通常，色譜法用于根據相同蛋白質的標準曲線來量化樣品中游離蛋白質的量。色譜方法各不相同，可能包括尺寸排阻色譜(SEC)或反相高效液相色譜(RP-HPLC)。典型的方法可以基于用于分析抗原原料藥(bulk drug substance，BDS)的方法，然后針對靈敏度進行優化并使用低水平標準曲線進行驗證。

　　一些免疫學測試方法在Alhydrogel或磷酸鋁存在的情況下是可行的，可用于鑒定，或在某些情況下，無需解吸即可進行定量。雖然蛋白質印跡不是一種實用的替代方法，因為SDS-PAGE不能在FDP上進行，但狹縫印跡和點印跡消除了分離步驟。在狹縫印跡或斑點印跡法中，產品直接施加到膜上，并可以使用微濾裝置和真空將其拉過膜。可以根據需要進行額外的沖洗，以確保沒有表面殘留物留在膜上。在將樣品、標準品和對照應用于膜后，將膜從裝置中取出并使用標準程序進行免疫印跡。雖然沒有確定公開的程序描述使用點或狹縫印跡分析鋁吸附疫苗，但該技術用于定量流感疫苗中的血凝素和神經氨酸酶的分析。點和狹縫印跡的一個優點是可以同時分析多個樣本，并且可以將膜切成條狀以使用多種抗體進行免疫印跡，從而可以同時識別多種抗原。有文獻也證明了直接鋁凝膠制劑免疫測定(DAFIA)用于確定抗原身份和含量的可行性。在該方法中，將FDP添加到黑色多滴定板的孔中。離心和洗滌后，封閉孔，然后用一抗探測，然后用熒光素標記的二抗探測。

　　可以使用電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP-AES)直接測定鋁佐劑的濃度。傳統的蛋白質定量方法，例如UV-Vis光譜或RP-HPLC不適用于結合抗原。USP方法6<1057>利用鄰苯二甲醛(OPA)已應用于鋁水凝膠疫苗。OPA與N端胺基或賴氨酸側鏈上的胺基反應，并在340nm/455nm處產生熒光信號。FDP的蛋白質濃度與標準曲線進行比較。OPA方法應用于含有Alhydrogel的瘧疾候選疫苗，并確定為獲得準確結果，Alhydrogel 必須以與樣品相同的濃度包含在標準中。準確度為87-100%，線性范圍為25-400μg/mL。在內部研究中，該方法使用非線性曲線擬合的范圍為20-250μg/mL，結果準確度為98-110%，樣品重復性≤2%(參見下圖1中的代表性標準曲線)。

　　圖1.模型疫苗的鄰苯二甲醛(OPA)標準曲線。

　　有人也提倡將生物制藥開發中常見的制劑前研究應用于含鋁佐劑的疫苗。除了表征佐劑和游離抗原外，還建議評估抗原-佐劑配方，以了解吸附強度以及蛋白質抗原的結構和化學穩定性。

　　HPLC不適合分析完整的鋁吸附FDP，因為疫苗分子會被柱篩板過濾，或者如果它們確實進入柱子，會導致柱堵塞和背壓增加。RP-HPLC已應用于濃度測量，并在一定程度上用于解吸后疫苗的化學穩定性。雖然對完整抗原進行色譜分析需要進行解吸步驟，但肽圖分析提供了一種強大的工具來驗證FDP的身份以及評估吸附后和穩定性期間抗原的化學穩定性。在肽譜分析中，蛋白質被酶(如LysC或胰蛋白酶)消化以產生一組肽。所得的肽混合物可以通過色譜法分離，并與對照或BDS進行比較，或者可以通過質譜法進行分析，并與基于一級序列的肽的預期質量進行比較。還可以使用帶飛行時間檢測(MALDI-TOF)的基質輔助激光解吸質譜法分析肽混合物，而無需進行分離。Lys C消化解吸抗原，然后對含有Alhydrogel的三價肉毒桿菌疫苗進行MALD-TOF分析，檢測到所有三種蛋白質抗原的氧化和脫酰胺反應，并且在佐劑存在下反應速率加快。最初使用250mM琥珀酸鹽緩沖液(pH3.5)解吸樣品，但在孵育后，解吸變得更加困難，因此需要使用4M尿素pH7.5緩沖液。解吸本身使分析復雜化，因為首先，它可能無法完全重現，特別是對于穩定性樣品，其次，它可能導致額外的降解。在未發表的研究中，胰蛋白酶用于成功消化與Alhydrogel結合的抗原而不會解吸。在pH8.0的Tris/HCL緩沖液中，在37℃下孵育4小時的標準消化程序，然后是使用ACN/TFA流動相和C18柱的RP-HPLC。色譜圖(參見下圖2)消化后的FDP與消化后的BDS緊密匹配，表明非解吸肽圖是評估FDP中抗原穩定性的可行方法。隨著高質量準確度/高分辨率質譜儀的可用性不斷提高，肽圖分析已演變為多屬性方法(multi-attributemethod，MAM)，它可以替代治療性蛋白質的多種電泳和色譜穩定性指示方法。MAM在鋁吸附疫苗中的應用有機會進一步了解蛋白質抗原穩定性并改進分析以支持質量源于設計(QbD)的開發以及質量控制(QC)的批放行。

　　圖2.未消化的BDS(藍色)、消化的BDS(紅色)、消化的成品(FDP)(綠色)、BDS空白(粉色)、FDP空白(藍色)和胰蛋白酶空白(紫色)的UV220nm色譜圖。

　　MAM有可能取代在分析前都需要解吸的電泳和色譜穩定性指示方法。解吸方法從使用磷酸鹽緩沖液pH7.4、磷酸鹽緩沖液和Zwittergent、250mM琥珀酸鹽緩沖液pH3.5到更苛刻的條件，例如20mM十二烷基硫酸鈉(SDS)或20mM氯化十六烷基吡啶檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液和高達4M的尿素。多位研究人員指出，穩定性樣品的解吸更具挑戰性。因此，穩定性指示方法的解吸程序的開發應盡可能使用穩定性樣品進行。解吸方法的選擇將根據所使用的佐劑以及預期的分析方法和與解吸溶液的兼容性而有所不同。例如，在實驗中使用SDS的方法(例如 SDS-PAGE或CE-PAGE)制備樣品時，SDS將是解吸緩沖液的不錯選擇。此外，SDS不會顯著干擾RP-HPLC。尿素通常用于毛細管電泳(ICE)成像程序的樣品制備，并且是制備用于電荷分離方法(如ICE和離子交換色譜(IEX))的樣品的首選緩沖液。使用SDS進行解吸的標準方案包括以下步驟：尿素通常用于毛細管電泳(ICE)成像程序的樣品制備，并且是制備用于電荷分離方法(如ICE和離子交換色譜(IEX))的樣品的首選緩沖液。使用SDS進行解吸的標準方案包括以下步驟：

　　混合緩沖液、SDS和疫苗FDP，并在70℃下孵育10分鐘。

　　離心，去除上清液，并使用RP-HPLC測定蛋白質濃度。確保參考標準中的SDS濃度與樣品中的濃度相匹配。

　　使用超濾過濾器濃縮并用水洗滌脫鹽。在分析前利用體積確定近似濃度。

　　尿素解吸的標準步驟遵循類似的程序：

　　混合緩沖液、尿素和疫苗FDP，并在冷藏條件下搖晃18小時。

　　離心，去除上清液，并使用RP-HPLC測定蛋白質濃度。確保參考標準品中的尿素濃度與樣品中的尿素濃度相匹配。

　　透析樣品以降低尿素濃度。

　　重復RP-HPLC分析以確定濃度，使用超濾過濾器濃縮并用水洗滌脫鹽。

　　執行ICE或IEX分析。

　　解吸后，可以使用標準程序和商業凝膠和試劑進行SDS-PAGE。如下圖3所示的模型疫苗的分析使用預制凝膠(Thermo Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris)和推薦的樣品和運行緩沖液(NuPAGE LDS樣品緩沖液和NuPAGE MOPS SDS運行緩沖液)。凝膠已在 37℃下儲存0至5天的SDS解吸模型疫苗樣品的分析結果。上樣前將樣品還原并使用考馬斯藍染色劑(NuPAGE膠體藍染色試劑盒)染色。通過光密度測定法(Bio-Rad GS-800密度計和Quantity One軟件)分析凝膠是否存在由于降解以及純度百分比導致的額外條帶。主條帶的純度范圍從第0天樣品的96%到第4天和第5天的90-91%，因此證明解吸SDS-PAGE方法具有穩定性指示。

　　圖3.用于熱處理樣品的模型疫苗十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠。MW=分子量標記，RS=標準，C=對照樣品，T0-T5=37℃下儲存的天數，B=空白，S=靈敏度標準。

　　模型BSA-Alhydrogel疫苗的ICE分析是使用成像毛細管電泳系統進行的，檢測波長為280nm(ICE280和ICE3系統，ProteinSimple)。如前所述，使用尿素解吸和透析制備樣品，然后使用超濾過濾器濃縮。樣品、參考物質和對照樣品在稀釋劑中稀釋，稀釋劑由緩沖液4-6.5、緩沖液液3-10、1g/mL尿素、0.7%甲基纖維素和pI標記物5.12和6.61組成。使用酸性陽極電解液(0.1%甲基纖維素，0.08M H3PO4)、堿性陰極電解液(0.1%甲基纖維素，0.10M NaOH)進行分析，并在3000V下分離10分鐘。分析所得電泳圖(ChromPerfect 7軟件)的同種型純度。模型疫苗樣品在分析前在37℃下儲存0至5天。下圖4的電泳圖疊加顯示了每個樣品的異構體分布。在非降解樣品中，在pI6.1和6.2處觀察到主峰，但在37℃下儲存更長時間后，觀察到顯著轉變為更酸性的同種型。解吸ICE方法是穩定性指示，用于檢測異構體分布的變化。

　　圖4.已在37℃下儲存長達五天的尿素解吸樣品的成像毛細管電泳(ICE)電泳圖疊加。

　　結論

　　鋁吸附疫苗的性質對通常用于治療性蛋白質穩定性研究的傳統生物分析方法的應用提出了挑戰。雖然研究表明吸附導致蛋白質抗原的結構和化學修飾，并且吸附可能影響穩定性，但除了推薦之外，幾乎沒有提供監管指導，包括藥物產品放行測試中的特性、純度和效力。效力方法可能沒有必要的準確性和精確度來預測疫苗在整個產品保質期內的有效性和穩定性。取而代之的是，下表1中提出了一組改編自傳統治療性蛋白質分析的測試。盡管從歷史上看，抗原表征是在解吸后進行的，但大多數提出的方法都可以直接在FDP上進行。隨著基于MS的肽圖分析方法(例如MAM)的日益普及，可能不再需要先解吸再使用電泳和色譜方法來確定碎片或化學修飾。